Virološki studije. Crijevne bolesti. (Part 5)

Primjeri korištenja Western blot-za proučavanje proteina strukture RRV-2, SA-11, DS-1 rad Pavlov et al. (1991). Primjenom hiperimunog seruma, autori provodi imunoblot analizom VP1, VP2, VP4, VP7 - referentni sojevi rotavirusa majmuna i čovjeka. Kasnije, Zeng P. i sur. (1994), pomoću Western blot-tehnike, a potom pomoću monoklonskih antitijela za imuno-blotting, VP2 ispituje funkcija, SA-11, sklop čestica mehanizam VP2, VP2 / 6 i transport metabolita unutar jezgre.

Najčešća metoda molekulske hibridizacije je RNA-RNA hibridizacija točkastim upijanjem i Northern blot-. Dot-blot (dot hibridizacija) je vrlo jednostavan za jedan molekularne hibridizaciju igrač kvantificiranje virusne nukleinske kiseline. Sjeverni-blot - varijanta molekularne hibridizacija, naznačen time, da izdvajanje nukleinskih kiselina ekstrahira sa elektroforetski matrice, prenosi i imobiliziran na čvrstu površinu faze u istom slijedu kao što su oni u gelu. U isto vrijeme, korištenje Dot-blot'e i Sjeverne-blot'e sondama specifičnim genima rotavirus, uključujući VP4 i VP7, omogućuje izolati su upisali izravno na materijal od pacijenta.

Molekularna hibridizacija metoda koja se koristi u dijagnostici rotavirusa infekcija (Novikova, A. et al., 1991, 1998- Krasko A. G. i sur., 1991 Ginevskii VA i sur., 1992.-Fer-nandoz J. i sur., 1992.-Steele i sur., 1996. M. Husain et al., 1996), ali češće za zadatke, kao što piše izolat studije atipičnih sojeve međuvrsna i međugrupni preslagivanjem tijekom studije u Molecular epidemiology, i međuvrsna i međugrupni preslagivanjem (Gorrell Ry i suradnici, 1996. Kuzuya M. et al, 1996. Nakagomi 0, Nakagomi T., 1991 (a, c) - .. 1996. Ward R., 1990, 1991. do Qian Y. i sur., 1991. do Palombo E. et al., 1998).

Teorijski mogućnost primjene mjesto hibridizacije u dijagnozi humane RV infekcije je pokazana Krasko A. G. i dr. (1991). Kao proba 32P-obilježenog svinjskog RV genoma segmente prepisane in vitro aktiviranjem endogenog RNA-polimeraze ovisnosti Sima RNA i transkripti su dobiveni za sve segmente 11 RV.

Primjena ovog postupka pomoću sonde u RNA RV SA-11, također označen s 32P, ostavljena Novikova N. A. et al. (1991) za otkrivanje RV RNA u nazofarinksa od 29 (76.3%) od 38 pacijenata koji potvrđuje RVGE genom transkripcija mogućnost RV u stanicama sluznici nazofarinksa.

RNA-RNA hibridizacija dijagnostička vrijednost pokazana Fernandoz J. et al. (1992) 303 na uzorcima inspekciju stolice od pacijenata RVGE strane dot-blot. Oligonukleo tidny-sonde koja se sastoji od 40 područja 33-72 nukleotida genski VP7 većina konzervativne mnogo rotavirusi. Kao oznaka se koristi biotin (biotin-dATP 7). Uz dot-blot je korišten EF PAGE i ELISA. Tu su identificirani 230 pozitivnih slučajeva potvrđeno dot hibridizacije i EF STRANICI. ELISA pokazao manje pouzdani, koji je otkrio 7 lažno pozitivnih i lažno negativnih uzoraka 12. Osjetljivost metode je 200 pg (Fernandoz J. et al., 1992). Rezolucija Northern blot-a je bila veća za 6,0 pg ostavljena otkrivanje homologni RNA, gdje sonde ne reagiraju i 100 ng heterologne RNA (Ali A. i sur., 1993).

Pomoću specifičnih sondi različitim G- i P-tipa otvorila je mogućnost da se jasnu sliku optočnih rotavirus u različitim područjima svijeta (Sethabuthz O. et al., 1992.-Husain M. et al., 1996. Correll RY i sur., 1996. Isa P. i sur., 1996. Ada M. et al., 1997).

RNA-RNA hibridizacija je ostavljena da se dokumentirati prisutnost međugrupne preslagivanjem, koji se javlja u in vivo, kao i u uzgoju rotavirus pripadaju različitim geno na kulturi stanica (Ward R., 1990., 1991).

Ova metoda je također u mogućnosti preciznije opisali pripadnosti određenoj virusa u određenoj skupini. Rotavirus sigurno podjela I i II podgrupa u ovom stadiju nije posve neistinito, tj. Nisu svi izolata. Fit „u već poznatim karakteristikama. Na primjer, AU-1 soj ne odgovara karakteristiku podskupine, imaju ipak dugo foretipom. Samo korištenje RNA-RNA hibridizacije podataka moguće od identificirati ovaj soj i slične ih izolira se u odvojenoj skupini (Nakagomi O., Nakagomi T. 1991. (a, b) - 1992). Osim toga, hibridizaciju RNA-RNA klasificira rotavirus na genetskoj razini (npr. N. Genogrouping), koji je posebno vrijedna za proučavanje atipičnih rotavirusa izolata (Nakagomi G., 1996).

Osim RNA-RNA hibridizacije prikazuje uporabu RNA-DNA hibridizacija (Southern blot-). komplementarna DNA (DNA) dobiven je u tu svrhu reverznom transkripcijom genomske RNA u različitim segmentima. Pokazalo se da je promatrana najučinkovitiji hibridizacija kada se koristi kao cDNA probe u segment 3 RV genoma. Kao oznake se koriste s 32P. Učinkovitost Dot-blot hibridizaciju RNA-DNA je 0.5 ng. U ovom posebnom studija je pokazala da su cDNA proba ne daju unakrsne reakcije s drugim skupinama RV RNA (Eiden J. i sur., 1989).

Treba primijetiti da su pridržna baza RNA-DNA hibridizacija za diferencijaciju serotipova u prisutnosti 50% formamida prolazi reakciju strogo određeni (Rosen V. et al., 1990). Nadalje, provođenje reakcije hibridizacije moguće je ne samo da se s oligonukleotidima obilježenim 32P, a alkalne fosfataze (ALP). Osim toga, korištenje oba markera u studiji 148 uzoraka po RNA-DNA hibridizacija pokazali su slične rezultate (Sethabutr O. et al., 1992).

Southern-blot je naširoko koristi u otkrivanju rotavirusom genoma i okoline. Upotrebom RNA-DNA hibridizacija RV je otkriven u vodi za piće, tla, voda (Ginevskii VA i sur., 1992.-Zothikumae N. et al., 1995.-Grinde V. et al., 1995.-Dubois E , et al., 1997).

Tako, metoda hibridizacije karakterizira neusporedivo veću osjetljivost i specifičnost od laboratorijskih testova, a može se uspješno koristiti kao referenca za procjenu. Oni su univerzalni metoda dijagnosticiranja i tipizacija rotavirusa i omogućuje tipkanje sama izolata u materijalu od pacijenata.

Posljednjih godina, temeljem najnovije biotehnologije i genetski inženjering razvili jedinstvenu metodu dijagnoze virusnih zaraznih bolesti pomoću lančane reakcije polimeraze (PCR). Za razliku od tradicionalnih ELISA tehnikama hibridizacije bugačenjem, osigurati pouzdanu detekciju 0,1-10 milijuna ciljnih molekula (antigena ili nukleinske kiseline), PCR postupak omogućuje da identificiraju samo jedna molekula nukleinske kiseline u uzorku.

PCR se temelji na dva osnovna svojstva nukleinske kiseline - razdjeljenju sintetizira dvostrukih pramenove genomske DNA i ponovne sinteze temelju ovih komplementarnih nukleinskih strukture.

Za reakciju ispitivanog uzorka s proteinazom K i fenol-kloroform izolirane nukleinske kiseline (Oischi J. et al., 1993- Gouvea V. et al., 1991). U vezi s potrebom za korištenje toksičnih tvari, kao što su fenol, kloroform, klorfluorugljik, daljnja metoda je razvijena dvolančanu izolaciju RNA i pročišćavanja temelji se na uporabi gvanidina, gidrooksiapatita tsetiltri metil-bromid (Santos N., Gouvea V., 1994) , Postupak je jednostavan, učinkovit, omogućuje oslobađanje RNA inhibitori enzima, a daje veći prinos od virusne RNA. Denaturira žarenjem (90 ° C) nukleinske kiseline se nalaze u mediju obogaćenom sa primere nukleinskih kiselina i termostabline DNA polimeraze. Pri 36 „C na odvojenim DNK s DNA polimerazom sintetizira komplementarnu strukturu. Temeljni premazi odrediti koji dio RNA se reproducirati, a dodatak stop-kodona rezultira činjenicom da polimerizacija nije cijelom dužinom DNK lanca, a samo jedan dio lanca, odgovorni su za pojedine funkcije genoma, t. E. Gruppo-, tip- ili serospetsificheskie genoma. Temperatura se zatim povisi na 58-60 ° C, što je dovelo do sintetizirati dvolančanih lomova. Temperatura je snižena do 36 ° C, i sintezu komplementarnih lanaca ponavlja u dvije sekcije već lanaca i t. D. Kao posljedica čestih ponavljanja ovog postupka, broj strogo specifičan za svaki od patogena nukleotidnih sekvenci povećava za nekoliko redova veličine. Teoretski osjetljivost jednostavno ukloniti, kao što je u ovom slučaju jednog lanca mogu dobiti od 1000 puta nakupljanje nukleotidnih sljedova. Ovaj postupak ne zahtjeva radioaktivne izotope uključen u milijun puta osjetljivija od metoda pomoću standardnog elektroforeti namakanje dsRNA - genoma i dijelove 5000 puta osjetljiviji tehnika molekularne hibridizacije (Xu, L. et al, 1990) .. Prema Eiden J. et al. (1991) PCR osjetljivost u rutinskoj istraživanju pristupi femtokolichestvam (80 FG).

Treba primijetiti, da se kao polazni molekula za PCR može se koristiti u DNK ili RNK iz cDNA pomoću reverzne predtretmana traskrip-tazoy zatim amplifikacije. RNA dobiven iz oba svježe pripremljenih stanica, tkiva i smrznuta liofi liziranje-sredstvima ili fiksne, tj. E. objekata prethodno dostupna za analizu. Ova vrsta poznata kao PCR revertaznoy natrag transkriptatsionnoy lančane reakcije polimeraze (RT-PCR). Suština ovog modifikacija je korištenjem PCR oligonukleotnyh par početnica koji može specifično hibridizirati na nukleotidnih sekvenci na suprotnim krajevima lanaca dijela dvije DNA. Kao primeri za simultanu sintezu komplementarnih lanaca pomoću termostabline DNA polimeraze. Ponovljenih ciklusa denaturacije dvostruke uzvojnice DNA lanaca nakon dovršenja žarenja sa klica dovesti do eksponencijalnog porasta broja DNA fragmenata na obje strane nukleotidne sekvence koje odgovaraju primarne strukture klica. Kao rezultat, količina 30-40 ciklusa reakciji amplifikacije DNA molekula u uzorku je povećana na 108-108 puta, što omogućuje da se odredi TsPDvo 104 / ml, a ne daje ukrižene reakcije sa drugim virusima (Kweon S. N. et al., 1997). Istovremeno, niti jedan od RV para klica nije reagirao na RT-PCR s fekalne uzorcima koji sadrže rotavirus iz druge skupine, kao i uzoraka iz kontrolnih nezaraženih ljudima i životinjama, što ukazuje na visoku specifičnost metode (Eiden J. i sur., 1991).

Amplificirani sekvence mogu se vidjeti u UV svjetlu PCR produkata nakon rastavljanja elektroforezom na gelu u prisutnosti etidijevog bromida (Gouvea V. et al., 1991. do Oishi I. et al., 1993). Dobivena količina DNA fragmenata je dovoljna za analizu od strane drugih molekularnih-bioloških postupaka: Dot-blot hibridizacije, sekvenciranja, kloniranje i druga.

Trenutno provodi izbor primera za detekciju A, B i C gena rotavirus grupa, 9, 8 i 6, odnosno (Gouvea V. et al., 1991. do Oishi I. et al., 1993- Buesa I. et al., 1996 ). Način RT-PCR je korištena za određivanje Rotavirusi čak iu slučajevima kada druge metode ne dopuštaju da ih prepoznati (Ushijima N. i sur., 1992.-Oishi I. i sur., 1993- Jiang B. i sur., 1995). U posljednjih nekoliko godina, predstavljamo podatke o korištenju PCR za G- i R-serotipa RV. Autori su pokazali da je najčešće naći u rotavirus ljudi koji pripadaju vrstama G1-G4 i P4, P6, P8 i P10 (Taniguchi K. i sur., 1992.-Correll RJ, Palombo EA, 1996. Husain M. i sur., 1996. Espinoza F. et al., 1997). Ovi podaci nam omogućiti da brzo dobiti detaljne informacije o molekularnoj osnovi epidemioloških varijacije rotavirus, što je izuzetno važno u epidemiologiji i izgradnju rotavirusa cjepiva (Richardson S. i sur., 1998- Leite I. i sur., 1996- Arista S. et i sur., 1997 Ada M. et al., 1997).

Unatoč velikom broju studija potvrđuje superiornu specifičnost i osjetljivost PCR, brojni autori provodi usporedni test ovu metodu s tradicionalnim dijagnostičke metode: ELISA, EF PAGE, TEM. PCR veće osjetljivost u odnosu na ELISA pokazala Wilde J. 103 uzorak stolica se dobije 40 ispitivanje djece. PCR detektira 60 pozitivnih slučajeva (53%) u usporedbi s 37 (36%) u IFA. Nadalje, prosječno trajanje virusne izlučivanja jednaka 9,5 dana za podatke PCR, u usporedbi s 5.6 dana (IFA Wilde J. et al., 1991). Slični rezultati, koji pokazuju visoku osjetljivost PCR u usporedbi s ELISA, dobiven Tani-guchi K. identifikacije 115 kopromaterialov iz bolesne djece izumitelji da je dijagnoza potvrđene s PCR-om od 93% u odnosu na 82,6 pomoću ELISA. (Taniguchi K. et al., 1992).

Noviji radovi u potpunosti je potvrdio ove rezultate. Tako, uspoređujući PCR PAGE i ELISA se koristi za detekciju u rotavirus materijala bolesne djece, postotak pozitivnih nalaza: 94, 91 i 80%, odnosno (Husain M. et al, 1995). Slični rezultati dobiveni su tijekom ispitivanja 220 pacijenata IKP. Postotak otkrivanje rotavirusa na materijale osoba ispitanih PCR, ELISA, SDS i TEM, odnosno 30, 29, 26,8 i 25,4 (Buesa J. et al., 1996). . Prema Masendyacz R. et al, osjetljivost i specifičnost, na metode detekcije tri RV kopromaterialyah diareje pacijenata su: PCR - 92% i 98 - RNA-DNA hibridizacija - 80 i 99% - IFA - 73 i 81% (Masendyacz R. et al., 1998).

Kao što je prikazano od strane prijavljenih podataka, analiza rotavirusom RNA sve se provodi u praksi, unatoč određenom složenosti i visoke cijene istraživanja, a koristi se i za dijagnostiku i za karakterizaciju patogena. Ovaj proces je intenzivirana s razvojem PCR, najosjetljiviji i specifične dijagnostičke tehnike koje, prema mišljenju mnogih autora, trenutno je „zlatni standard”, što je ranije bio TEM (Nakagomi O. i sur., 1994. do Masendyacz R. et al ., 1998).

Dakle, PCR je molekularna biološki test nove generacije, koji se otvara velike mogućnosti u razvrstavanju, tipkanje, opće i molekularnu epidemiologiju rotavirusa. Međutim, treba napomenuti da je PCR zahtijeva visoko kvalificiranih istraživača, skupe reagense i relativno komplicirana opremu. U isto vrijeme, daljnje usavršavanje metoda, očito je da se PCR više dostupni za širok raspon dijagnostičkih laboratorija.

Rezimirajući korištenje metoda identifikacije rotavirusa u različitim istraživačkim ustanovama, to je da su gotovo sve od materijala raspravlja u ovom postupku ima svoje prednosti i nedostatke, izražena u različitim stupnjevima. Primanje brzinu odziva, mogućnost pregledati velik broj uzoraka istovremeno, metoda složenosti i potrebu za korištenje skupe opreme i reagentiki, osjetljivost i specifičnost metode i, na kraju, cijena analize svake od ovih metoda uvelike razlikuju. Dakle - izbor odgovarajuće metode u svakom slučaju je individualno i nije lak zadatak s obzirom na veliki broj testova različite mogućnosti dijagnostičkog laboratorija i izazove ih suočava.