Virološki studije. Crijevne bolesti. (Part 4)

Primjena RKOA paralelno s IFA, a pokazao je blizu RAL korelacija koristi rezultate (Zhang Y. i sur., 1989- Pereira V. et al., 1992.-Jap K. et al., 1992). Međutim, postoje informacije o izgledu nespecifičnih reakcija kopromaterialami, koja se može ukloniti pomoću apsorpcijske prethodnu obustavu stafilokoka. U isto vrijeme, unatoč podudarnost rezultata RKOA istraživanja materijala i IFA, osjetljivost i specifičnost bila je niža od one ELISA, a može se usporediti s lateks aglutinacije (Jap K. et al., 1992).

Dakle, rezultati RKOA dopustiti da ga preporučiti za dijagnozu infekcijom rotavirusom u laboratorijima, gdje postoji mogućnost korištenja više osjetljive i specifične metode. Međutim, nedavno je testiran u modifikacije RKOA i radioimmunoprecipitation s protein A Staphylococcus aureus značajno poboljšati osjetljivost i specifičnost testa i proučiti imunološki odgovor na VP2, VP6 i nsp2 u serumu i kopromaterialah djece s RV infekcije (Colomina I. et al., 1998) ,

Reakcijska lateks aglutinacija (RAL) koji se koristi u laboratorijskoj praksi zbog nastojanja u posljednjih nekoliko godina tendencijom za korištenje kao nosači za antigene i antitijela inertne plastike. U tu svrhu koristi polistiren lateks - standardnih sintetskih veličine globule čestica oko 0,8 mikrona. Manje čestice veličine (0,2-0,3 um) pohranjen u reakcijama sporo i zahtijeva vrijeme za kuhanje ultratsentrifugatsii diag-stikuma, velikom otvoru (> 1 mm), čime se dobiva često nespecifične reakcije. Lateks čestica, prethodno adsorbira protutijela (antigen), steknu sposobnost da se agglutinated u prisutnosti homologne antigena (antitijelo) i vizualizirani su specifične antitijelo-antigen kompleksa. Poboljšati specifičnost i osjetljivost čestica lateksa mogu senzibiliziranih imunoglobuline (Amer A. i sur., 1990). Zbog jednostavnosti i brzine studije, kao i niske cijene lateks-aglutinacije koriste u laboratorijskoj praksi vrlo široko: Ruggeri F. et al, 1992 ..

Trenutno uređen proizvodnju komercijalnih sustava za ispitivanje za lateks aglutinacije, što je osnova za rad na usporednoj procjeni njihove dijagnostičke učinkovitosti.

Generalizirani rezultati ocjene Ria i drugim laboratorijskim metodama su otkrili da Osjetljivost i specifičnost u usporedbi s RLA TEM, ELISA, EF PAGE bila dovoljno visoka i iznosi 70-96% i 80-100% čađe-pripadnom (Santos N. et al. , 1989- Molyneaux PJ i sur., Amer 1989- A. et al., 1990. Hendricks MK et al., 1995). Upotreba monoklonskih antitijela je dodatno pojačan dijagnostičku vrijednost Ria (Dennehy R. et al., 1988- Zbinden R. et al., 1992.-Sanchez R. et al., 1993).

Uz komercijalni lateks sustava i istraživači koriste laboratorijske testove koji daju rezultate usporedive s njima (Amer A. i sur., 1990.).

Istovremeno, brojni autori su istaknuli da je uporaba Ria nije bez nedostataka, jer daje određeni broj lažno pozitivnih nalaza. Tako, u ispitivanju 200 bolesnika djece i pomoću ELISA detektira RLA 11 uzoraka na lozhnonegativnyh stope jednake osjetljivosti i specifičnosti 86 i 95%, odnosno (Amer A. et al., 1990). Kasnije, drugi autori u anketi 585 uzoraka stolice oboljele djece od strane Ria i EF STRANICI dobila osjetljivost i specifičnost od 96 i 100%, respektivno. Nađeno je 6 lažno negativnih i lažno pozitivne rezultate u 3 razliku Faradayevog učinka u nAAT. (Zbinden R. et al., 1992). Prema Hendricks, MK et al. Ispitni 103 djece u dobi od 1 mjeseca do pet metoda godina TEM EF stranicu i RLA pokazali da je osjetljivost tih metoda je jednaka 84, 90 i 80% i specifičnost od 100, 100 i 81% respektivno. Autori otkrili 15% lažno pozitivne rezultate u skladu Ria (Hendricks M. K. et al., 1995), koji se mogu povezan s digitalnom rotirajućem-virusnih gastroenteritisa s krvi u ispitivanom tvari. U tom smislu, priprema pozitivnih reakcija u Ria s uzorcima koji sadrže krv, rezultati treba tumačiti s oprezom i potvrđena drugim postupcima (Bendall R. et al., 1991).

Tako, RLA predstavlja vrlo jednostavne reakcije dijagnostičke detekcija rotavirus. Kao vrijedna metoda za brzu dijagnostiku i posjeduju visoku razinu osjetljivosti i specifičnosti ove metode, međutim, nema prednosti u odnosu na ELISA, TEM, EF PAGE, osim za brzinu reakcije i treba biti potvrđena od strane drugih metoda.

Rezimirajući materijala, treba napomenuti da je cijela sedimenta testovi su naširoko koristi u laboratorijske dijagnostike od infekcijom rotavirusom zbog visoke osjetljivosti i brzini dobivanja rezultata, jednostavnost formuliranja i računovodstva, kao i nedostatak potrebe da koriste sofisticirane opreme i skupe reagense.

Dijagnostičke metode koje se temelje na otkrivanju virusa specifične RNA. Razvoj tehnika molekularne biologije u virologiju dovelo do primjene u praksi brojnih novih dijagnostičkih testova koja se temelje na otkrivanju virusnih RNA. Njihova upotreba je otvorila mogućnost pristupa na molekularnoj epidemiologiji i pomogao riješiti neke od problema rotavirusa u taksonomiji. Jedan od prvih dijagnostičkih testova u ovoj grupi bio je elektroforeza gel od virusnog genoma.

Elektroforeza virusne RNA u poliakrilamid gelu (PAGE EF) je dovoljno fleksibilan i široko distribuiran kako u istraživanjima i praktičnim laboratorijima. Zbog svoje visoke specifičnosti i osjetljivosti, može riješiti niz pitanja vezanih uz infekcijom rotavirusom, a nađe koristiti u dijagnostici, epidemiologije i prevencije. Mogućnost primjene ove metode izazvao jedinstvenu strukturu distribucije u gelu jedanaest virusnog genoma segmentima i visoka stabilnost rotavirusom RNA djelovanjem čimbenika okoliša. Postoji nekoliko verzija EF PAGE. Donekle razlikuju jedni od drugih, svi oni se temelje na ekstrakciji rotavirusa RNA, destilaciju RNA izolirane poliakrilamidnom gel elektroforezom pod utjecajem električnog polja i vizualizaciju rezultata destilacija RNA virusnog genoma. Promjene mogu biti u svakoj od tih faza EF PAGE. Tako, rotavirus RNA izolacija se može provesti izravno iz izmet, zaobilazeći stupanj dobivanja pročišćenog virusa- moguće prethodno odvajanje jednostrukom i dvolančanu RNA, 32P davanje oznake, obrada materijala sa nukleaze S1, uništavajući jednolančane RNA varira struktury- sastav puferske otopine, postotak dijeljenja i koncentrirajući gelya- struje iz elektroforezu, bojenje metode. vrijeme studija je 24-36 sati. Kao rezultat toga, trake na gel nakon bojanja sa srebrnim nitratom ili etidij-brom-house profila identificirane virusnu RNK koja odgovara 11 segmente genoma virusa (Unicomb L. E. i sur., 1993- Assouli SM et al., 1995.-Bos P. et i sur., 1995.-Vasil'ev B. J. i sur., 1995.-Szczepaniak Z. et al., 1996. Holmes JH, 1996. Steele AD i sur., 1996. Markowska-Daniel J. i sur., 1996. Espinoza F. et al., 1997 Ada M. et al., 1997 Wu H. et al., 1998).

U skladu sa standardnim uvjetima Elektroforeza lokaciji genoma segmenata dovoljno stabilna i omogućuje identificirati izolat na temelju njegove osobne foregrammy. Treba primijetiti da je raspodjela genomskih segmenata na foregramme genetski otporan osobina i bilo kakve promjene u aminokiselinskom slijedu genoma podrazumijeva mijenjanje brzina migracije virusnih proteina (Kuzuya M. et al., 1996). Osim toga, priroda foregrammy urođenog specifičnom izolatu može poslužiti kao sredstvo za dešifriranje baklje identificirati načine i izvora zagađenja (Oishi J. i sur., 1993- Broor S. et al., 1993- beque R. et al., 1992). Osim toga, ova metoda dopušteno Rotavirusi podijeljeni u dvije podskupine s takozvanim „kratki” ili „duge” PHO-retipami (zbog manjoj ili većoj mobilnosti 10 i 11 genomskih segmenata) koja je bitna za razvrstavanje RV stanovništva. Prema tome, EF PAGE mogu uspješno koristiti u dijagnostici, epidemiologije i klasifikacija s obzirom na razne načine (RAL, GA, izolacije virusa u kulturi stanica) - -method reference.

Istraživanje provedeno od strane brojnih istraživačkih timova su pokazali da EF STRANICA ima visoku osjetljivost i specifičnost. Komparativna studija ovih parametara u odnosu na FE PAGE, TEM i RLA provedeno s 103 djecom ispitivanja pokazala su da je osjetljivost 90, 84 i 80% i specifičnost 100, 100 i 81% (Hendricks M. K. et al., 1995 ). Analogni podataka, koji uključuju dodavanje ovih metoda i PCR i IFA su dobiveni i Husain Buesa J. M. Međutim, osjetljivost FE PAGE, prema tim autorima, je nešto slabiji od rezultata PCR i ELISA, no specifičnost je 100% (Husain et M. i sur., 1995.-Buesa J. et al., 1996). Slični rezultati dobiveni su u istraživanjima kontakt izmeta od 50 pacijenata IKP metoda TEM, ELISA i EF STRANICI. Pokazatelji pozitivnih nalaza u EF STRANICI u EIA i EMP-a u iznosu od 28% od 35%. Međutim, treba napomenuti da se u tri uzorka, gdje rotavirus otkrivenih u TEM nisu, u skladu s Faraday učinka u zabilježen foregramma PAGE karakteristici rotavirus (Vasil'yev B. J. i sur. 1990). Stariji naše studije značajnog IKP 510 pacijenata koji koriste ELISA, TEM i EF PAGE, nam je omogućilo da potvrdi Rotavit kata etiologija bolesti kod 37 i 23% u (Vasil'yev B. J. i sur. 1995).

Maldonado A. et al. (1998) u komparativna studija kopromaterialov djece hospitalizirane s proljevom, metode EF STRANICA i ELISA dokumentirani RV bolesti prirode u 42,7 i 49,5% respektivno.

Treba napomenuti da osim horizontalne i vertikalne elektroforeza se koristi, što je, prema nekim autorima, može se usporediti s vodoravnom specifičnosti i osjetljivosti, ali više jednostavno. Kada ga držite za prikaz autori predlažu da su rezultati bromid-DIY izravno u gel i koristiti isti gel za nekoliko studija. Oni su također dizajnirani s ultraljubičasto osvjetljenje uređaja, koji omogućuje jednostavan i udoban foregrammy čitanje (Zbinden R. et al., 1992).

Modifikacija vertikalne elektroforezom s postupkom za vizualizaciju foregramm posrebrivanje predloženi Giardano M. O. et al. (1997). Njihovi rezultati pokazali su da nove modifikacije osjetljivost, specifičnost, i jeftiniji od konvencionalnih FE PAGE.

Dakle, FE metoda STRANICA trenutno naširoko koristi u laboratorijima u različitim zemljama za RV dijagnostike. Brojni usporedni testovi ove metode s TEM, migracije, RAL i ELISA pokazuju visoku specifičnost i osjetljivost, kao i mogućnost korištenja Faradayev efekt na stranicu kao referentnu metodu za učenje novih sustava za ispitivanje. Korištenje poliakrilamid gel elektroforeza kako prepoznati izvore zaraze i načina njegovog širenja, kao i dekodiranje etiologiji pojave bio je osnova za uspješno rješavanje stvarnih problema molekularne epidemiologije.

proteini prijenos postupak (Western blot-) ili nukleinske kiseline (dot-blot ili Northern blot-a Southern-blot) u elektroforetskoj matrice i njihovo imobilizacija na čvrstu površinu faze naziva blotting i dobiveni otisak prsta - blotiranjem. Kada se analizira blotogramm pomoću imunog seruma tehniku ​​nazvanu imunoblatin.

Kao sonde obično koriste ili RNA prijepis in vitro na matrici virusnog genoma ili komplementarnim DNK klonova dobivenih u matrici virusnog genoma korištenjem reverzne transkriptaze i naknadne Molecular Cloning. Ranije probe obilježene s izotopima provodi 125J ili 32P, ali u posljednjih nekoliko godina koristi ne-radioaktivnih naljepnice - biotin ili enzima, što znatno pojednostavljuje postupak jer uklanja pitanja izotop sigurnost (alkalna fosfataza, peroksidaze, itd.). U ovom slučaju rezultati reakcije su zabilježene u obliku boja mrlja koje nastaju pod utjecajem enzima na supstrat je dodan, što ukazuje da je proba hibridizirana virusa RNA u materijalu.