Virološki studije. Crijevne bolesti. (Part 2)

Primjena metoda TEM pokazala visoku specifičnost, ali njegova osjetljivost je inferioran niza drugih laboratorijskih testova. Materijale 207 iz dva bolesnika s ELISA i dijagnostička sredstva i TEM kao referentnom metodom pokazala da TEM osjetljivost od 80% u 100% specifičnošću, a osjetljivost ELISA temelju monoklonskih antitijela bio je veći (Dennehy R., 1990). Slični podaci dobiveni su prethodno Vasilevym B. J. i sur. (1989). Usporedive omjeri indeksi osjetljivosti i specifičnosti TEM i aglutinacije reakcija lateks (62.5% i 75%, redom), također su se pokazala i Nozawa Santos N. S. (1989).

Nedavne studije su potvrdile ove nalaze. Ispitivanje 103 djece metoda TEM EF PAGE i lateks aglutinacije reakciji (Ria), pokazali su da rotavirus je dokumentirano u 18% djece. Nadalje senzitivnost TEM tehnike EF PAGE i RLA je odnosno 84%, 90% i 80%, specifičnost kao 100%, 100% i 81% u (Hendricks M. K. et al., 1995). Osim u dijagnostičke svrhe, TEM se koristi u istraživanju i razvoju. Tako, Zeng, et al. (1994) je korišten u studiji TEM-digitalnom rotirajućem virusne VP2 proteina.

Rezultati izravno elektronska mikroskopija slici proširene funkcija i montaže strukturni protein VP2, kao i formiranje čestica nalik virusima (HPV) i transport metabolita unutar viriona.

Posebno veliki napredak postignut u proučavanju morfologije rotavirus modifikacijom TEM - krioe elektrona mikroskopom koja omogućuje proučavanje nativnog neobojenu viriona 35a s rezolucijom koji omogućuje da se otkrilo površinske strukture virusa i kanala koji prodiru u virion (Yeager M. et al ,. 1990- 1994, Estes M., 1996. Prasad V. et al., 1996).

Dakle, direktna elektronska mikroskopija je učinkovit dijagnostička metoda i optimalna refe-Laurence-testa tijekom razvoja novih dijagnostičkih metoda u pogledu dobivenih neosporne rezultate, što je rezultiralo u velikom broju istraživača vjeruje elektronskim mikroskopom „zlatni standard» (BRYDEN A. S., 1990). TEM je jedinstven u svoju sposobnost detektiranja sve druge rotavirus i drugih patogena crijevnih skupine: adeno-, kalitsi-, astro i koronavirus, kao i do sada nepoznate infektivna sredstva (Espinoza F. et al, 1997.).

Immunoelectron mikroskopija (IEM) daje mogućnost ne samo za identifikaciju virusa u materijalu od pacijenta prema svojim morfološkim karakteristikama, ali i kako bi potvrdili etiologiju bolesti na određenoj razini. Princip rada je sljedeći: imuni serum za rotavirus u razrjeđenju 1: 5 pomiješa se s 0,4 ml 1% fekalne suspenzija razbistri centrifugiranjem. Smjesa je inkubirana tijekom 1 sata na sobnoj temperaturi, 12 sati pri 4 ° C, a zatim centrifugirana tijekom 90 minuta pri 15 000 okretaja. / Min u talog čestice virusa i imuni kompleksi. Nadosa-je sjajne dekantiran i talog je ponovno suspendiran u nekoliko kapi destilirane vode, koje su obojene (kao što je gore navedeno), a primijenjena u predmetnom mreže. Mikroskopija izvršena je sa porastom droge 50.000.

U ovom slučaju, Rotavirus čestice s karakterističnom morfologija i veličina su identificirani u specifičnog imunog formiranja kompleksa koji intenzitet se ocjenjuje od broja klastera na rešetku i izražen proizvoljnom ljestvici od 0 do 4+.

Osjetljivost i specifičnost migracije mogu natjecati ne samo s EMP, ali čak i sa takvim zajedničke metode, kao što su ELISA. Prema tome, za tipizaciju 24 sojeva rotavirusa putem ELISA i migracije na temelju monoklonskih protutijela na VP7 Nađeno je da u IEM 2-16 puta osjetljivija od ELISA (Gerna G. et al., 1988).

Osim standardne tehnike migracije u radovima nekoliko autora proučavao specifičnost i osjetljivost nekoliko modifikacija ove metode: filtriranje kompleks agar imunosorbcnt IEM i makromarkirovaniya složene bjelančevine koloidne zlatne. Pokazano je da su sve izmjene IEM barem 20-30 puta osjetljivija od izravnih metoda. Najveća osjetljivost realizacija razlikuje označen protein A - koloidno zlato, koji je 1000 puta osjetljivija od izravnog metodi migracije (Athanassions R. et al, 1994. do Gonzalez S. A. et al, 1995.,). Očito je da daljnje poboljšanje migracije će otvoriti nove mogućnosti za ovu metodu, ali njegova visoka osjetljivost se može postići pažljivim standardizaciju reagensa, softver con trol, kao i visoke kvalifikacije istraživača.

Opseg IEM je opsežna: istraživanje i razvoj, klinička praksa, laboratorijska dijagnostika, uključujući i tipkanje od rotavirusa soja transkript epidemija epidemija i sl (Gerna G. i dr, 1988- Vasiliev BJ et al, 1989- Bates ... R. R. et al., 1993- Oishi J. i sur., 1993- Zeng C. et al., 1994. do Tokieda M. et al., 1996).

IEM (kao TEM) koristi se kao referentno ispitivanje za procjenu osjetljivosti i specifičnosti indeksa komercijalnih kitova (Ruggeri dijagnostičkih F. et al., 1992). Ilustrativni vrijednosti koriste metode IEM dekodiranja u epidemiološkim izbijanja može poslužiti podaci Oishi J. (1993). Dakle, kada se izbijanje gastroenteritisa kod studenata na koledžu u Japanu TEM morfoloških značajki u izmetu pacijenata pronađeni su rotavirus. Nadalje, ti materijali imaju negativan relativno ELISA rotavirus grupe A. Primjena IEM je pokazala da ovi rotavirusi su agenti grupe C, što je kasnije potvrđeno pomoću PCR podacima.

Rezimirajući rezultate TEM i migracije, treba napomenuti da su ove metode imaju veliku važnost u početnim fazama dijagnozu infekcijom rotavirusom. Međutim, u budućnosti, s razvojem metoda otkrivanja rotavirusa-antigena vrhunskog FEM migracije i osjetljivosti, jednostavnosti i brzine mogućnosti skrininga velikog broja niskih materijalnih troškova, TEM i migracije daje časnu ulogu referentnih metoda.

U isto vrijeme, TEM i migracije i sada se koristi u istraživanjima i kliničkoj praksi, obje metode za otkrivanje novih infektivnih agenasa su nepoznati.

Metoda imunofluorescencija (IPM) koji se koristi u dijagnostičkim testovima za otkrivanje antigena u staničnoj kulturi zaražene materijal od pacijenta, u biopsijama i obdukciju materijala, a kopromaterialah dvije modifikacije.

Načelo izravne metode IPM sniženim na predmet obrade (inficirane stanice ili sekcije tkiva) specifična antitijela koji su označeni fluorescentnom bojom, koji je u kontaktu s antigenom, dobije fluorescentnim mikroskopom pod utjecajem kratkog valne duljine vidljive valne duljine luminiscencije (zelena ili crvena, ovisno o vrsti boje) , U indirektnoj metodi, objekt se podvrgne dva stupnja obrade IF prvi imuni serum željeni antigen i zatim obilježene s fluorokromom imunoglobulina izolirane iz seruma antispecies.

Metodologija IPM je krajnje jednostavna: tragovi, inficirane stanice, pročisti fekalne suspenzije su pričvršćene na stakalca s acetonom pri sobnoj temperaturi kroz 10 minuta. Pripravak se zatim obrađuje s fluorescentnim rotavirusom serumom a kontrastne pozadine albumin rodamin konjugata. Nakon inkubacije na 37 ° C tijekom 30 minuta, višak konjugat se ispere s fosfatnim puferom (pH 7,0), ispere, osuši i pregled pod fluorescentnim mikroskopom. Treba napomenuti da uzimanje kopromaterialov u prvih sati od početka povećava mogućnost otkrivanja rotavirusa antigena. Kada se provodi IPM potrebno uključiti kontrole, koje se uglavnom koriste: liječenje određenog konjugata neinficiranih stanica-tion, i - heterologne konjugat stanice inficirane s rotavirus. Najčešće se koristi u studijama IPM kulture tkiva zaraženih materijala iz bolesnih ljudi ili životinja, omogućujući vam da brzo otkriti virussoderzhaschie.kletki bez čekanja CPP (ISRC Islands LA, 1988- Harsi C.et sur., 1991. do Tokieda M et al., 1996). 46 (17,1%) - tako 40 pozitivnih uzoraka (14,9%), u immunnofermentnom testu su identificirani u istraživanju u IPM i EF u bolesnika s gastroenteritisa strana 268 djece mlađe od 1 godine. Podudarnost rezultata tih metoda je opažena u 72% slučajeva (Harsi C. et al., 1991).

Posljednjih godina, oznaka imunofluorescencija antitijela široko se koriste za detekciju žarišta (plyak) rotavirus u kulturi stanica, što uvelike poboljšava osjetljivost ove metode (Iz P.et al., 1994. do Barnes G. et al., 1997). IPM primjenjuje i za otkrivanje rotavirus u vanjskom okruženju (Strappe R., 1990).

Dakle, trenutno imunofluorescencija metoda istraživanja u klasičnoj verziji ima ograničenu primjenu u dijagnostici rotavirusom gastroenteritisa.

Pretsipitatsionnye testovi se temelje na interakciji sa specifičnim virusnih antigena u serumu na agaru pod utjecajem osmotskih procesa (RPG) ili kada je podvrgnuta statičkog električnog polja - protu-immunoelectrophoresis (VIEF) (Galko NV et al, 1986- Zalesskikh A. F. et al. ., 1990). Ove metode se koriste u ranim fazama studiranja infekcijom rotavirusom, a sada gotovo ne primjenjuju u odnosu na razvoj boljih testova, osim finog istraživanja (Devitt S. i sur., 1993). Međutim, pretsipitatsionnye Testovi su poboljšani uvođenjem u reakcijsku rotavirusa čestica označenih 32P, koje će povećati osjetljivost oba i specifičnost testa (Tosser J. i sur., 1994. do Johansen K. i sur posljednjih godina., 1994. do Richardson S , et al., 1993- Colomina J. et al., 1998), kao i protein od Staphylococcus aureus (Colomina J. et al., 1998).

Imunosorbent testa (ELISA) u dijagnostici rotavirusom gastroenteritisa koristi najčešće. Broj publikacija na tu temu nekoliko stotina.

Načelo metode ELISA smanjuje na činjenicu da je nosač od polimernog materijala (mikro ploče bušotine, kuglice, štapići i dr. D.) su obložene s antitijelima na rotavirus dodano test materijala iz pacijenta i inkubira na 36 ° C Nastali kompleks detektira AT-AG, ili protutijela obilježena enzima ili seruma prvo tretira na željeni antigen i zatim naučiti iz dobre Antiva-imunoglobulina označene sa enzimom. Detekcija kompleksa AT-AT + AH enzim ili AT-AH-AT1-AT2 + izvedbi dodavanjem enzimatskog supstrata za pojavu obojenog produkta reakcije. Razmatranje rezultata reakcije provode se pomoću analizatora imuno testom. Pored otkrivanja antigena rotavirusom ELISA također može provesti serotipiziranje se izolira u materijalu od pacijenata. Za ovu svrhu, postupak je predložen za blokiranje određene epitope RV genoma pomoću tip monoklonsko antitijelo ili podskupine specifičnosti (Green K. et al., 1990). Upotreba monoklonskih antitijela VP7 i VP4 različitih serotipova humanih rotavirus ne samo da omogućuje za unos izolata, ali također potiče proučavanje procesa epidemija (Bishop R. et al., 1989- Gerna G. et al 1989- UnicombL. I sur., 1993- Buesa G , et al., 1996. J. Gomez et al., 1990. Begue R. et al., 1992.-Coulson BS, 1993- Woods P. et al., 1992.-Nirdnoy W. et al., 1995.-H Wu , et al., 1998- Masen-dyzac P. et al., 1998).

Prvi ELISA kompleti su nastale kao laboratorijski testovi na kraju 70-ih, a zatim i komercijalni proizvodi su razvijeni. Prvi komercijalni biranje Rotazyme (Abbott Laboratories doo), koja se koristi u kemijskom sustavu. Zatim Dako doo je stvorio više savršen set - Fast ELISA Dako doo, a sada broj komercijalnih testova koji se koriste u dijagnostičkom praksi je izuzetno visoka: IDEIA rotavirus test, Dekopatts, ispitivanje sustava SZO, Testpack rotavirus, rotavirus PUO, Pathfinder, Kallestadt | Rotaclone, rotavirus BIO - Bioenzabead Litton, Rotazyme II Abbott, Rotoscreen, Wellcozyme, Enzymgnost rotavirus, rotavirus Immunoassay, VIDAS rotavirus, NIV (Gowez J. et al, 1990. Begue R. et al, 1992.-Rosmus K. et al .. ., 1992.-Kelkar S., 1993- Unicomb L. et al., 1993- Sanchez R. et al., 1993- Broor S. et al. 1993- Dennehy P. et al., 1994).