Rv iii generacije cjepiva. Crijevne bolesti.

Također smo napravili pokušaj da se identificiraju „prazne” viri iz koprobiomassy RV. Metoda velike brzine centrifugiranjem u gradijentu gustoće cezijevog diskontinuiranog klorida ili sulfata (1.0-1.5 g / cm2), bili smo u mogućnosti podijeliti čestica za RV „pune” i „prazan”, što je potvrđeno elektrona mikroskopsku kontrolu.

Tako je utvrđeno mogućnost odvajanja RV zajamčeno njihove uzgonskom biomase gustoća koja se može koristiti kao sredstvo ili koraka pročišćavanja, koncentracija i nakupljanje virusnog materijala u dizajnu dijagnostičkih i preventivnih lijekova (Vasile u B. J. et al., 1991) ,

Razvoj genetskog inženjeringa pristupa u stvaranju RV cjepiva ogleda se u pokušajima da simuliraju tzv podjedinica cjepiva.

Korištenje HPV kao cjepiva kandidata koji induciraju zaštitni učinak na cijepljenje, to je neki evolucijski put. Postupak za proizvodnju formulacije cjepiva na osnovi VP6 bio predmet zahtjeva za izuma (Sahara M. et al., US Patent, 1990).

Autori konstruiran pripravke koji se nalaze epi-topnye molekule vezan na proteinski nosač monomera ili oligomera u polipeptida homolognih VP6, koje nastaju HPV. VP6 gen je izoliran rekombinantni plazmidi i zatim kompleksira s različitim polipeptida RV.

Prethodno je pokazano da je unutarnja kapsidni VP6 protein ima sposobnost da samostalno sastaviti. Na temelju tog fenomena koji se trenutno ostvaruje mogućnost dobivanja virusima slične čestice (HPV) za imunizaciju životinja. RV geni koji kodiraju strukturne proteine, kloniran je u bakulovirus te rekombinantne RV ko-ekspresiji proteina u sustavu bakulkovirusa (Estes MK i sur., 1996. Crawford S.E. i sur., 1994. do Labbe M. et al., 1991). Ekspresijom proteina samosobira-RV nastaju i HPV. Ko-ekspresija raznih kombinacija strukturne proteine ​​HPV dovodi do nastajanja različitih proteinskih sastava.

Nedavni podaci pokazuju da parenteralna primjena inaktiviranog RV laboratorijskih životinja dovodi do njihove potpune zaštite protiv homologne oralne infekcije, što je bilo moguće procijeniti šanse za alternativnim načinima cijepljenja s HPV-om.

Koristeći Kloniranje i ekspresija u sustavu bakulkovirusa strukturnih proteina VP4, VP6 i VP7 RV RNC (soj C 486) Redmond M. et al. (1993) su dobiveni od HPV-a, koji sadrži ili se temelji na VP6 VP4 ili VP7. Miševi u pokusima namijenjen HPV izazvana humoralnih antitijela otkrivene migracije. Međutim, samo HPV VP4 pobuđena antitijela koja neutraliziraju virus i hemaglutinacijsko inhibiciju. Infekcije miševa imuniziranih s HPV prisutnosti VP4, pronašli su zaštitno djelovanje protiv homolognih (C) i 486 heterologna (SA-11) RV. Nasuprot tome, miševi tretirani samo potomci uz prisustvo HPV VP6, pokazao je djelomično zaštićen.

Zatim imunogena aktivnost i zaštitna efikasnost parenteralno davanje HPV različitog sastava (VP6 / 7 / VP2 6/7, VP2 / 4/6/7) i pomoćna sredstva A1 OH, QS21 proučavan Conner ME et al. (1996).

Autori konstruiran različit sastav u HPV coinfection SF9 stanice (0.2 ili 5 pfu) po stanici s različitim kombinacijama bakulovirusom rekombinanata (Crawford S.E. i sur., 1994). Bakulovirusne rekombinanti su korišteni u modeliranju kodira HPV VP2 (RF) ili VP6 (486 ° C) KRS- VP6, P [2] VP4 ili G3VP7 majmun ili Gl VP7 (8697) HRV. HPV se očisti s gradijentom gustoće cezij klorida ili 40% saharoze.

U postupku ispitivanja različitih pripravaka HPV rekombinanti strukturnih proteina dvostruko injektirane miševe (0,2-20 ug) i kunića (10-20 mg), zatim s infekcijom RV SA-11 i ALA. Nađeno je da zečevi cijepljena sa VP2 / ili 4/6/7 VP2 / 6/7 inducira visoku razinu seruma i RV coproantibody IgG klase, ali ne i IgA i IgG indukciju fekalne povezana s djelomičnu ili potpunu zaštitu od infekcije oralnu RV ALA. I to ne nađe utjecaj bilo koje pomoćno sredstvo u intenzitetu imunog odgovora. U miševa, slični rezultati su dobiveni s tom razlikom što je adjuvans s odgovorom induciranog QS21 HPV protutijela (ELISA podataka i PH), usporediva s onom postignutom s imunizacije RV SA-11. Intenzitet imunoloških promjena ovisi o dozi HPV. Treba napomenuti da su miševi imunizirani s VP2 / 6/7 ili VP2 / 4/6/7 također su otkriveni i heterotipskoj serumu i coproantibody. Ta činjenica je posebno važna u smislu da pokazuje mogućnost smanjenja broja G-vrste unesene u cjepivu podjedinice, a to, pak, sugerira mogućnost HPV dizajna s ograničenim brojem proteina, čime se smanjuje njihov trošak. S obzirom na HPV VP6 / 7, oni, također, bili imunogeni u miševa, ali njihova relativna nestabilnost nije pomoglo njihovo razmatranje kao potencijalni kandidati za cjepivo. Kao rezultat ispitivanja, autori su zaključili da HPV može osigurati sigurnu i učinkovitu alternativu ili dodatak živog cjepiva RV za ljude i za životinje (Conner M. T. et al., 1996, 1997).

Procjena učinkovitosti različitih HPV načinima primjene, kao i njihov sastav i posvećena nova Imunoadjuvantni rad O'Neal S. et al. (1997). Autori su proučavali imunogenost i zaštitna efikasnost oralnu ili nazalnu primjenu cjepiva koje sadrži RV podjedinice VP2 / 6 i G3 2/6/7 pomiješa s toksinom kolere. Utvrđeno je da je oralno davanje odraslim miševima pokazala HPV inducira pojavljivanje u serumu i IgA i IgG coproantibody klase. Nadalje, visoke doze (100 mg) pomogao u zaštiti od HPV naknadne infekcije RV (> 50% smanjenje virusnog prolijevanja) u 50% miševa.

Intranazalno davanje Postupak HPV stimulirane intenzivniji od oralne, i lokalna proizvodnja antitijela u serumu. Miševi koji su primili HPV intranazalno, zaštićena su od ponovne infekcije, izolacije virusa nakon infekcije je odsutan. Nije bilo razlike u imunogeničnosti i zaštitni učinak između 2/6 i 2/6/7 HPV-om. Treba naglasiti da je zaštita postignuta bez zaštitnih VP7 i VP4 antigena.

Zanimljivi rezultati dobiveni su pri proučavanju učinak imunomodulatora - toksin kolere u imunogenosti i zaštitne učinkovitosti HPV-om. Intranazalna primjena VP2 / 6 bez toksin kolere izazvalo formiranje seruma i crijevnih antitijela u nižim titra u usporedbi s imunološkim promjene u njenoj primjeni.

Upotreba visokih doza (100 mikrograma) VP2 / 6 bez adjuvansa stimuliraju samo djelomični smanjenje virusnog ljuštenja na prosječni 38% zaraženih miševa.

Istovremeno pod sličnim uvjetima i zatim imunizacije infekcije miševa visoku razinu zaštite kada se daje adjuvans je postignut s dozom od imunogena je deset puta manji (10 pg) nego se prije. Dakle, intranazalna primjena HPV imunološki adjuvans, prema autorima, može poslužiti kao prototip za sigurnu ne-replicirajući RV cjepiva ne samo za životinje, već i za ljude.

Uz toksin kolere (CT), pod eksperimentalnim uvjetima, autori su također ispitani i toksina osjetljiv na temperaturu od E.Coli: LT i LT R129G.

Utvrđeno je da je 2/6 od HPV-a koristi sve ove imunoadjuvanata izazvanih značajnu zaštitu od miševa protiv naknadne RV infekcija. Međutim, miševi koji su dobili 2/6 HPV u kombinaciji s pomoćnim sredstvom LT, proizveli značajno viši titar crijevne IgA antitijela u usporedbi s CT. Sve miševa koji su primili HPV 2/6 s LT i LT R192G, potpuno su (100%) zaštićen od RV infekcije, dok CT - 91%. Imunoadjuvantni LT i LT 192 g pokazao bezopasne i učinkovite imunostimulatori koje su omogućile autore da ih preporučiti za korištenje s HPV (O'Neal S. et al., 1998).

Kao novi smjer prevenciju infekcija RV je nedavno predložen DNA cjepiva koja kodira strukturni proteini RV (VP4, VP6, VP7) i ima određeni straže potencijal. U razvoju cjepiva osim posljednje generacije imunoadjuvanata u svom kombinirani pripravak se primjenjuje kao mrtvim bakterijama ili njihove antigene, kao što su Salmonella malopatogennye i tsitomegalovi-rus, poliovirus, adenovirus, virus boginja.

Treba napomenuti da je perspektiva razvoja i korištenja klonirane Enterobacteriaceae (osobito E. coli) koja sadrži genom DNA fragmenti ljudskog RV kodiranja za sintezu virusnih specifične antigene kojima se raspravlja u kasnim 80-ima (koji je droga Inf., 1989). Kao vektor koristi RV virus (Poncet D. et al., 1990). Kao rezultat toga, razvoj genetskog inženjeringa je dizajniran s rekombinantni virus umetnuta u timidinkinaze gena cDNA VP6 SA-11. Infekcija ovog rekombinantnog MA 104 stanica rezultirala ekspresijom VP6, kojem je izazvana imunizacijom miševa formiranje antitijela, međutim, imaju virus neutralizirajuća aktivnost.

Imunološki odgovor na izražene rekombinantnih virusa vakcinije strane antigene može biti uvelike poboljšana „sidrenja” potonjeg na ljusci postaje zaražene stanice. Amplifikacija i imunogenost VP6 VP7 može dogoditi neposredno putem B-stanica i aktivirane T-pomoćničkih (Andrew M. et al., 1991).

S obzirom na činjenicu da se, kao što je prikazano ranija opažanja, parenteralna primjena osigurava RV cjepiva u miševa i kunića zaštitu od infekcija (Conner M. T. et al., 1993- McNeal M. et al., 1995), Herrmann IE et al. (1996) proveo istraživanje na osnovi mogućnost korištenja DNA cjepiva za prevenciju infekcije RV. Rotavirusa DNA cjepiva su pripravljeni ugradnjom komplementarnu DNA koja kodira mišju VP4, VP6 ili VP7 u ekspresijskom vektoru (Yasutomi Y. i sur., 1996). RV DNA cjepivo je intradermalno pomoću tzv genski pištolj (genske pištolj).

Postupak «genske pištolj» se sastoji u tome DNA vakcina adsorbira zlatnih zrnaca (0,95 nm), koji su uvedeni u epidermu od helija impulsa (Accell gena gun- Agracetus, Middleton, WI). Ovaj postupak je najučinkovitiji način za isporuku potrebnu količinu DNA cjepiva epiderme (Fynan E. F. et al., 1993).

Plazmid DNA cjepiva (VP4, VP6 i VP7) ispitana je u pokusima na odraslih miševa (BALB / c) prema njihovoj sposobnosti da induciraju imuni odgovor i štiti protiv infekcije RV Edima. Utvrđeno je da tretman miševa dvostrukom DNA vakcine 0,4 ug popraćene povećanim titrom IgG protutijela (za ELISA podataka) na prosječno od 1: 300, a pomoću VP4 VP7 i 1: 3200 - imunizacija VP6.

Istodobno određuje VNA u miševa tretiranih s live virus (Edima), njegovog VP4 DNA cjepivo i VP7, ali ne u životinja imuniziranih sa DNK cjepiva VP6. Uz porast titra protutijela humoralnog povećane, a sadržaj IgA antitijela klase, najveći postotak zabilježen je u miševa cijepljenih s DNA VP6. CTL aktivnost mjerena je za određivanje stanične imunosti. Kada je omjer efektora prema cilju 60: 1 vrijednost specifičnog lizu inficiranih miševa RV Edima, je jednaka 57 ± 27%, a pri VP4 cijepljenja - 32 ± 14% - VP6 - 33 + 31% - VP7 - 42 ± 17% - plazmid za kontrolu DNA - 2 ± 2%.

Tako, dva puta primjena plazmida DNK cjepiva, VP4 VP6 i VP7 pokazao zaštitu sličnu onoj kod miševa oralno su tretirani sa živom RV Edima na 100 ID50- Herrmann J. et al. To je pokazalo da mehanizam zaštite koji su uključeni stanični imunitet, IgA posredovano unutarstanični neispravan neutralizacije virusa ili oba ova faktora. Autori smatraju da su rezultati pokazuju efikasnost plazmida VP4, VP6 i VP7 DNA vakcine stimulaciju oba specifična antitijela i CTL (Herrmann J. i sur., 1996. S. Chen C. et al., 1997). U isto vrijeme, Choi A. i sur. (1997) su izvijestili da DNA VP6, inducira visoku razinu seruma pretežno IgG, ne može osigurati zaštitu protiv naknadne infekcije.

U posljednjih nekoliko godina posvećenih cjepivo-ke-RV infekcija su pojmovi „sluznice cjepiva” i „sluznice imunitet”. Sluznice cjepiva sluznice (oralni, intranazalni, enteralna, ali dr.), A uključuju specifične antigene i pomoćna sredstva zatvoren u mikrokapsulama, koja ih štiti od djelovanja probavnih enzima i otpornosti na niske vrijednosti pH.

Postupak RV mikrokapsuliranje se temelji na sposobnosti ionnosvyazannyh vodi topljivih polimera i anionski amina poboljšala proizvodnja imuniteta virus-specifičnih, kao što je pokazano Knoury S. A. et al. (1995), Brown K. A. et al. (1995). Miševi imunizirani oralno inaktiviran enkapsulirani neinkapsuli i RV-Rowan majmuna u dozama od 1,75 mg ili 0,35, određuje prisutnost specifičnih antitijela u serumu i crijevnih sadržaja u kulturi organa enterički povezanog limfoidne (GALT). Utvrđeno je da su virus-specifičnih IgA proizvodi limfocita tanka lamina propria crijeva životinja imuniziranih s dvije doze mikro-roinkapsulirovannogo majmunski RV. Miševi cijepljeni sa unencapsulated RV, bili su imunološke. Dakle, autori su pokazali da mikrokapsulirova-set može biti učinkovit u indukciji virus-specifičnih odgovora Galt nakon oralne primjene malih količina virusnih antigena. Osim toga, autori su pokazali mogućnost mikrokapsuliranog cjepiva s određenom razdoblju biorazgradnje ima pojačano djelovanje. Treba naglasiti da je novi način za isporuku cjepiva za zaštitu antigen od učinaka crijevnih enzima i raznih nepoželjne tvari, preda izravno na Peyer-ova (M. Estes, 1996).

Dakle, rezimirajući razvojnih faza vaktsinopro-profilaksa, treba napomenuti da je najveći napredak u zaštiti protiv RV infekcija povezana s razvojem i raznolikosti testova živjeti polivalentnu reassortant cjepivo dizajniran na osnovi ukupne neto Jenny Rovsky pristupa i genetskog inženjeringa. Tijekom opsežnih kliničkih i epidemioloških istraživanja provedenih u različitim regijama svijeta na kontingenta odraslih i djece svih uzrasta, oni su pokazali svoje neškodljivosti, niske reaktivnosti, visoki imunogeni aktivnost i učinkovitost u sprječavanju RV infekcija, te također u smanjenju pojave teških kliničkih oblika bolesti i hospitalizacije ,

Najviše obećava od polivalentnih reassortant cjepiva RRV-om i WC3, koji trenutno prolazi kroz završnu testiranje prije licenciranja.

Uz gornjih vakcina II generacije u posljednjih nekoliko godina namijenjenih podjediničnih cjepiva ne-replicirajući vektor DNA i nalaze se na pretkliničkim koraku provjere valjanosti.

Pozitivni rezultati dobiveni u eksperimentalnim uvjetima u životinja, upućuju na to da njihovo istraživanje može se proširiti i na ljude.