Virološki studije. Crijevne bolesti. (Dio 1)

Izolacija virusa. Detekcija virusnih agensa - pobudnog patološkog stanja je glavni trijada Koch dokaz infekcije uzroka. U tom smislu, izolacija virusa je izuzetno važno i temeljno je karika u lancu događaja za laboratorijsku dijagnostiku infekcijom rotavirusom. Osim prolijevanja i dalje je jedna od rijetkih praksi koje se mogu pratiti do otkrića novih virusnih agenasa, sredstva iz nepoznatog sada virusnih bolesti. Dakle, izolacija virusa u različitim biološkim modelima (u većini slučajeva - u kulturi stanica) vrlo su široko prakticira. Trenutno, kao biološki uzorak se najčešće koristi niz staničnih kultura: MA104, 4647, GBK, HT-29, CV1, Vero, Caco-2, itd (Ramishvili L. G. et al, 1991 J. Hapchaev .. X. et al., 1989- Clark N. et al., 1988- Konno T. et al., 1993- Ward R. et al., 1990. Bernstein D. et al., 1989- Sato K. et al. , 1995- Weber B. et al., 1992.-Markovska-Daniel J. i sur., 1996. Shinozaki K. et al., 1996. Superti F. et al., 1997).

Izolacija virusa u staničnim kulturama provedeno u 2 faze: infekcija virusom staničnih kultura (I) i njegova produkcija na dokumentiranje izgled CPE ili ELISA, IPM, PAGE, PCR metoda plyakoobrazovaniya TEM i (II). Zbog posebne važnosti ove metode možemo dopustiti da nas neki detalj. Uzorci stolice uzeti u prvih 2-3 dana bolesti u sterilnom laboratorijskog stakla i transportira u spremnik s ledom ili druge tvari. Test materijal koji se obrađuje neposredno nakon unosa u laboratoriju ili se skladišti na niskim temperaturama. Prije početka virološki uzorci se odmrznu, uzeti 0,5-1 g fekalija i medij za rast se doda (Eagle, Earl Henke) u količini koja je potrebna da se dobije 10% suspenzija. Mulj gomogeneziruyut ponavlja do uniformnosti snažno mućkanje (sa ili bez zrnaca), ili pomoću smrzavanja i odmrzavanja. Homogenizacija kaše više blago tresenje, t, K. Virusosoderzhaschego zamrzavanje i otapanje materijala dovodi do degradacije VP7 (Nirdnoy W. et al., 1995). Suspenzija se centrifugira 10-15 minuta na 1000-2000 g, oslobođenih iz sedimenta i supernatant se prelije ali 1 ml za viroloških studija ili pohraniti na -20-70 ° C, ovisno o periodu skladištenja. Nakon toga, virus je aktivirana tijekom 30 minuta na 37 ° C s tripsinom u koncentraciji od 10 ug / ml i centrifugira 2 minute na 15.000 g. Zatim, četiri dana monosloj ispere dva puta sa DMEM i inficirati 1-2 lg (10-30 virusnih čestica po stanici) na aktivirano RV mediju (DMEM, MEM s Hanks Eagle) s 10% fetalnog telećeg seruma i antibiotika za. Prema različitim autorima, mi koristimo 100-500 jedinica. penicilin, 100-500 mg streptomicina, 40 mg gentamicin i 50 jedinica. nistatin u 1 ml. Nakon 2 sata apsorpcije na 37 ° C, stanice su isprane i napunjene sa DMEM koji sadrži antibiotike i 4-13 ug / ml tripsina (Clark N. et al., 1988- Sato K. et al., 1995).

Pozitivan učinak na tripsin pokazao rotavirus replikacije procesa i T. Konno i sur. (1993). Autori potvrdio da je tripsina aktivira proizvodnju virusa selektivno utječu na funkciju VP4 i vanjskog kapsidni protein, njima se raspada. To vodi, s jedne strane, kako bi se smanjila GEMAG-glyutiniruyuschey virus aktivnost, as druge - kako bi se poboljšala prodor virusa u stanicu, koja je do tretira s tripsin virusi ući u stanicu i replicirati ga i sirovo - .. Najava endocitoze, a ne replicirati. Tako, primjena tripsina u dozi od 0,1 do 10 mg / ml rezultira povećanom infektivnosti virusa. Kulture zaražene stanice su određena za 5-7 dana. Pojava CPE ukazuje na prisutnost virusa, koji se zatim dokumentirano TEM EF PAGE pomoću protuseruma ili - migracije i Ifm al.

Ako ne CPE su smrznute kulture i dodatne prolaza u istim uvjetima, osim što je virus aktivira tretiranjem s tripsinom 4 g / ml pri sobnoj temperaturi tijekom 2 sata.

Jer prolaz 4, CPE tipično određivana je nakon 4-5 dana nakon infekcije (Ward R. et al., 1990. Bernstein D. et al., 1989).

Međutim, zbog niske osjetljivosti na kulturama stanica prirodnih izolata rutinskih metoda dijagnosticiranja rotavirus gastroenteritis tijekom virusaje nije. Zbog nepodešen se izolirati stanice mogu reproducirati u njima, bez otkrivanja CPE virusa dodatnim metodološkim postupcima značajno povećava učinkovitost metode. To potvrđuje istraživanje provedeno od strane W. Weber et al. (1992). Autori, uz detekciju rotavirusom CPD provedena komparativna studija nekoliko metoda za otkrivanje rotavirusa u zaraženim stanicama ispitivanjem uzoraka na 121 stolice od djece s gastroenteritisa prije dobi od 3 godine. Standardni izbor u MA-104 stanica pod kontrolom CPP pokazao samo 3,3% pozitivnih nalaza, dok je uporaba oznake imunoperoksidaznog dijagnostička razina povećava na 40,5%, a upotreba IFA i EF PAGE - do 54,4% i 46,3 %, respektivno.

Zbog HRV uvijek ne uzrokuje CPE i replicirati u konvencionalnim staničnim kulturama, Genthe V. i sur. (199TS nakon 18 sati u kulturi u MA-104 detektirana pomoću virusnog antigena intracelularni ELISA korištenjem antiseruma, dodan je peroksidazom obilježen. Usporedba tsitoimmunnoy tehnike označena antitijela s reklamom za postavljanje sustava za ispitivanje, ELISA i lateks aglutinacija pokazali da metoda tsitoimmunny 10 puta osjetljivija.

Slični rezultati dobiveni su u posljednjih nekoliko godina. Pa prema Markowska-Daniel J. i sur., ELISA rotavirus u fekalijama je pronađen u 32% slučajeva. Primjena MA-104 kulture i umnožavanja dokumenta IPM virusa, TEM i EF PAGE stanica povećava postotak otkrivanja virusa u 64,0% (Markowska-Daniel J. et al., 1996).

Klasični supstrat za reprodukciju rotavirus je stanice bubrega MA-104 majmuna koji se koristi najčešće, ne samo za dijagnozu, ali i za potrebe istraživanja (Johansen K. et al., 1997 Kobayashi N. i sur., 1995) i također u veterinarskoj praksi (Gulati V. i sur., 1997). Pokazano je da je MA-104 podržava ne samo reprodukcijske rotavirus iz grupe A i C, ali pod uvjetom da u visokoj koncentraciji u tripsinu medij za kulturu (sadržaj Tsunemitsu N. et al., 1991). Međutim, zbog nedovoljne osjetljivosti stanica na rotavirus održava kao potragu za drugim linije, stanice i postupaka prikladnih za izolaciju i reprodukciju rotavirusa i razvoj metoda za povećanje osjetljivosti stanica na rotavirusa. Nađeno je da stanična linija humanog karcinoma debelog crijeva HT-29 je osjetljivija od MA-104 u raspodjeli ljudskog rotavirusa. Nasuprot tome, MA-104 HT-29 rotavirus rasta detektirani u prvi ili više uzastopnih prolaza, čak i ako je postotak inficiranih stanica bila je niska (Superti F et al., 1991, 1997).

Druga linija karcinoma debelog crijeva Caco-2 stanica i koristi se za označavanje RV. Pomoću ove stanične linije u prisutnosti tripsina (4 ug / ml) izolirana skupina C RV u Japanu, koji je reproducirati bez CPP te je dokumentiran TEM IEM i Ifm povratne TPHA (Shinozaki K. et al., 1996).

Stanice bubrega goveda linija, GBK dao veće rezultate titracije rotavirus izoliranih iz listova (1-2 lg na više od MA-104 stanice). Treba primijetiti, međutim, da stanica je prethodno obrađen dietilaminoetildekstranom dozi od 50 ug / ml, a u mediju za održavanje doda se u tripsin kontsentartsii 5 g / ml (Konno T. et al., 1993).

Povećanje osjetljivosti stanica na viruse u cjelini, a posebno rotavirus postiže pomoću za tu svrhu kemijskim i fizikalnim metodama. To pokazuje da je centrifugiranje, konstantna njihanje ili iznenadna toplinski efekt (toplotni udar) potakne rast broja oštećenih stanica, povećanja prinosa virusa ili povećanje razine virusnog ljuštenja u dijagnostičkom Virology istraživanja. Od kemijske metode utjecaja Treba napomenuti učinkovitost dimetil, što pojačava proces transformacije stanica inficiranih virusom, plyak povećava broj i veličina povećava prinos virusa (Hyghes J. N., 1993). Tanji identifikacija virusa može se postići pomoću plakova formirana pod utjecajem u kulturi tkiva. Postupak za proizvodnju plakova razvijen Dulbecco R. (1952), u različitim verzijama, a široko se koristi u ovom trenutku. Princip metode je u tome razrjeđenje virusne suspenzije primijeniti na kulture tkiva monosloj u Petrijevoj zdjelici ploskostennyh bočice, plastične ploče jažice. Nakon adsorpcije na virus stanice prekrivene slojem hranjivom agaru. Zbog Agar poklopac, reprodukcija i širenje virusa je ograničena na samo početku zaražene i njihovih susjednih stanica. Tako oblikovan organski degeneracija stanica žarišta - tzv „plakova” (plyaki). Obično su identificirane bojanjem boje slojem intravitalnog stanica - neutralno crveno, što je bilo uključeno u sastavu premaza agara, ili o tome primjenjuju neposredno prije na temelju rezultata. Plakete ne apsorbirati boju i stoga biti u obliku svijetlih mrlja na pozadini obojenih živih stanica (Tosser J. et al., 1994).

Za otkrivanje plakete osim neutralno crveno mogu se koristiti i druge boje, kao što su kristalno ljubičastog. Jedan infektivni virus čestica predstavlja jednu ploču, koja omogućuje da se primjenjuju blyash-koobrazovanie kao točan postupak za kvantitativne studije virusa infektivnost i mjerenja aktivnosti neutralizacije antitijela. Korištenje plak može očistiti virus, tj. E. Primite svoje čiste linije (Isa R., Snodgrass D. 1994. do Ward R. i sur., 1998). U obavljanju takvih slojeva stanica za čišćenje nakon adsorpcije virusa potrebnog za oprati čestice virusa iz adsorbirane i tek tada primijeniti agar premaz. Treba primijetiti da upotreba dimetil sulfoksida, dietilaminoetildenetrana (DEAE), tripsina ima stimulirajuće djelovanje na formiranje plaka (i smanjenje koncentracije agara u oblozi).

Shgapo N. et al. (1987), korištena je metoda za dobivanje plakove za otkrivanje Raman rotavirusom kod novorođenih teladi usporedbi kulture stanične linije dva MA-104 i GBK (RNC stanice bubrega). Potvrđujući korištenje MA-104 stanica, predložili su da se koriste u tu svrhu ima GBK stanice linija i razvio izmjenu ploča. Plastična petrijevoj posudi promjera 6 cm posija 0.8-1.0 x 106 stanica u 5 ml medija za rast. Nakon 2-3 dana nakon formiranja jednoslojnih stanica su isprane i dodano je 2 ml (0 rotavirus soju Lincoln) razrijeđene u mediju za kulturu s 50 ug / ml DEAE. Nakon 90 minuta inkubacije pri 37 ° C položeno 5 ml medija za kulturu s 0,8% agar, 10% je juha triptoza fosfata, 5 g / ml tripsina i 50 ug / ml DEAE. Nakon 3 dana, drugi slojevita obloga sadrži neutralnog crvenog pri konačnoj razrjeđenju od 1: 5000. Nakon 6-8 sati su izbrojani chisyo plakete.

Još jedna modifikacija dobije plakove koriste Bernstein D. et al. (1989) u proučavanju odvajanje soja cjepiva u odraslih dobrovoljaca cijepljenih s cjepivom rotavirusom WC 3. U tu svrhu, 1 ml prethodno tretirani kao što je opisano gore, uzorci stolice su inkubirani 30 minuta pri 37 ° C s 10 ug tripsina i stavljene na monosloju MA- 104, ispere dva puta sa Earle-ovom uravnoteženom otopinom soli. Nakon 1 Chasa monosloja adsorpcijom na 37 ° C i ispere ponovno izlivena DMEM medij s antibioticima, 4 mikrograma / ml tripsina, 25 ug / ml DEAE i 0,2% agaroze i inkubira se 4 dana pri 37 ° C Druga oblogom agaru nakon uklanjanja medija s kristal violet za vizualizaciju plyak.

Trenutno, vizualizacija plyak postiže imunofluorescencije bojanjem ili radioaktivnom oznakom, kao metodu koja povećava specifičnost i osjetljivost (Isa R. et al., 1994).

Dakle, razrješenje i dalje važna metoda za potvrdu etiologije bolesti, ali sada zbog mogućnost korištenja širok raspon modernih dijagnostičkih metoda njegove primjene kao rutinskog dijagnostičkog testa čini nepraktičan.

Elektronska mikroskopija RV. Virus Detection elektronskim mikroskopom se provodi u dvije modifikacije: izravna elektronska mikroskopija (TEM) i immunnoelektronnaya mikroskopija (IEM).

Poznato je da se u prvim danima sadržaja bolesti rotavirus kopromaterialah dosegne takve količine koja omogućuju njegove detekcije elektronskim mikroskopom na D-20% kaše bez daljnje koncentracije. Nakon suspenzija se razbistri centrifugiranjem nekoliko kapi otopine Supernatant kontrastnih phosphotungstic kiselina (2,1%) (0,25-1 uranyl acetata%) ili amonij molibdat (1%) i nanosi na predmet elektronskim mikroskopom rešetke. Proučavani lijek provodi u elektronskim mikroskopom pod povećanjem od 50 otkriva 000. Pripadnost rotavirusa čestice određena je karakterističkom morfologijom.

Postupak izravnog elektronske mikroskopije (TEM) u različitim modifikacijama koristi za dijagnostičke i istraživačke svrhe, a široko (Vasil'yev B. J. i sur., 1989, 1995, 1996. Zarubinsky B. J. i sur., 1989- KHAUSTOV VI „et al. 1989- Shelkovskaya N. G. i sur., 1991. do Dennehy R. et al., 1990. Donneli G. et al., 1993- Zeng C. et al., 1994. do Oishi J. et al. , 1993- Gonzalez S. et al., 1995.-Hendricks MK i sur., 1995.-Jiang B. et al., 1995.-Buesa J. i sur., 1996. Tinari A. et al., 1996. Andrade GP et i sur., 1997 Superti F. et al., 1998).